Лу Фань, Оле Юнг, Маркус Херрманн, Марина Широких, Саня Стоянович, Стево Найман, Фабиан Кёрте, Синь Сюн, Катя Шенке-Лайланд* и Майк Барбек

Кросслинкирование коллагена с использованием ультрафиолетовых лучей А и рибофлавина (UVA/R) стало ключевым методом в клинической терапии, особенно в офтальмологии с 1990-х годов. Несмотря на клиническое применение, отсутствие ясности детализированного механизма и необходимость усовершенствованного производственного процесса требуют дальнейших исследований. Это исследование углубляет понимание коллагена с UVA/R, сосредотачиваясь на выявлении первичных участков сшивания с помощью семи синтетических пептидов и изучении путей кросслинков, опосредованного рибофлавина.

Результаты показывают, что остатки тирозина являются ключевыми участками перекрёстного сцепления, а рибофлавин играет двойную роль как катализатор и конкурентный ингибитор в процессе перекрёстного сцепления. Кроме того, перекрёстно связанная коллагеновая матрица UVA/R демонстрирует более гармоничный баланс между стабильностью и разлагаемостью по сравнению с химически связанными коллагеновыми матрицами, а также превосходящими механическими свойствами и усиленной биосовместимостью. Эксперименты in vivo продолжаются.

1. Введение

Коллагены широко используются в различных биомедицинских областях как функциональные биоматериалы, включая заживление ран, костные трансплантаты, регенерацию, офтальмологию, сердечно-сосудистую и нейротканевую инженерию.     Для оптимизации функциональности коллагенов, главным образом коллагена типа I (коллаген), в этих применениях часто необходима перекрёстная связка, улучшая их механические свойства, биоустойчивость, биосовместимость и другие функции. Среди различных технологий сшижения особенно перспективной техникой выделяется кроссшипинг ультрафиолетовых А-лучей и рибофлавинов (UVA/R), одобренный для клинического применения в офтальмологической терапии с начала 1990-х годов.   Это удобство и безопасность обладают огромным потенциалом для расширения применения коллагенов в различных биомедицинских областях.

Область фотосшивания UVA стремительно развивается, открывая многообещающие возможности в медицинских дисциплинах. Её полезность теперь включает создание инновационных гидрогелей, направленных на минимизацию послеоперационных спаек, что имеет потенциал для реолуционизации восстановления после лапароскопической операции. Кроме того, кросс-сшитые аклеточные свинячие роговицы UVA/R оцениваются как потенциальный каркас для диссертации Boston Keratopros, что отражает значительные успехи в биосовместимости и эффективности. Применение этой техники расширилось: благодаря инновационным методам, таким как безглутаральдегидная подготовка для кардиальных имплантов, инженерия тканей мениска, устройство для доставки контролируемых лекарств, а также расширение влияния на передовые исследовательские области, включая 3D-биопечать и системы «орган-на-чипе», демонстрируя динамический потенциал кроссшипа UVA/R в современной биомедицинской инженерии.

Несмотря на эти многообещающие применения, механизм, разрушающий UVA/R, остаётся предметом постоянных исследований и обсуждений. Многие исследования показывают, что рибофлавин в первую очередь функционирует как фотокатализатор, генерируя реактивные кислородные формы (ROS) для индуцирования окисления и полимеризации коллагена. Альтернативные теории предполагают, что это гораздо более комплексный фотохимический процесс, зависящий от воздействия кислорода и/или UVA. Также ведутся споры относительно специальных сайтов перекрёстного сшивания на молекулах коллагена: одни утверждают неселективность, другие указывают на аминокислоты, такие как ли-синус, гистидин, аргинин, тирозин или метионин.   

 Эти разные точки зрения на механизмы перекрёстного сцепления UVA/R подчёркивают недостаток всестороннего понимания, что приводит к ошибкам в стандартизации производственных процессов и в регуляторной оценке медицинских устройств. Чтобы устранить эти разрывы в знаниях и потенциально увеличить количество применения коллагена, наше исследование изучает фундаментальные принципы перекрёстного сшивания UVA/R.

Исследуя альтернативные механистические объяснения и раскрывая сложные взаимодействия между коллагеном и рибофлавином, мы предоставляем ценные инсайты, которые способствуют совершенствованию и оптимизации методов сшивания UVA/R.   Однако исследование механизма перекрёстного сшивания в коллагене представляет собой значительные трудности из-за динамических фотохимических процессов и молекулярной сложности коллагена. Для разгадки этих детальных механизмов необходимы передовые экспериментальные технологии и комплексные аналитические методы для точного выявления и характеристики переходных промежуточных и путей. Кроме того, вариабельность физических и химических свойств коллагена, на которую влияют источник, тип, обработка и факторы окружающей среды, добавляет сложности этим исследованиям, требуя тонкого подхода для полного понимания процесса перекрёстного сшивания.

В нашем исследовании мы применили инновационную экспериментальную рамочную работу, синтезировав семь синтетических пептидов, представляющих участки перекрёстного сшивания крестового потенциала на коллагене, с акцентом на аминокислотные остатки, такие как тирозин (Y), лизин (K), аргинин (R), меттионин (M), гистидин (H), триптофан (W) и фенилаланин (F). Эти аминокислоты были отобраны по их реактивным группам и положениям в неспиральной области молекулы коллагена, что более доступно для реакций перекрёстного сшивания и имеет решающее значение для усиления механических свойств.  (Рисунок 1) Подвергая эти пептиды и нативный коллаген различным соотношениям энергии UVA и рибофлавинов, мы расчленили процесс сшивания с помощью жидкой хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS). Мы также сравнили UVA/R-сшивание с химическими сшивателями, используя рамановскую микроспектроскопию для выявления различных молекулярных изменений после сшивания. Мы оценили механическую прочность, термическую устойчивость, устойчивость к разложению и цитотоксичность, что завершилось проведением in vivo имплантационных испытаний для оценки биосовместимости и потенциала регенерации тканей.

Анализируя процесс перекрёстного сшивания на молекулярном уровне, наше исследование открывает критические инсайты о ролях и взаимодействиях определённых аминокислот, проливая свет на сложную динамику сшивания UVA/R. Эти открытия имеют значительное значение для развития науки о биоматериалах, закладывая основу для разработки передовых, биосовместимых и механически устойчивых биоматериалов, тем самым прокладывая путь к более эффективным и безопасным биомедицинским приложениям.

Рисунок 1.  Схема перекрёстного сшивания коллагена UVA/рибофлавина. UVA: Ультрафиолет. Свет, источник фотоактивации. R: рибофлавин в основном состоянии. R*: возбужденное состояние рибофлавина при первом воздействии UVA. 3 R*: Триплетное состояние ри-бофлавин после межсистемного пересечения, состояние с более высокой энергией, способное вступать в реакции сшивания. O2: молекулярный кислород. 1 O2: синглетный кислород, реактивный вид кислорода, образующийся при передаче энергии от фотоактивированного рибофлавина к молекулярному кислороду. HO2 •: гидропероксил-радикал. RH: общая структура, представляющая донор водорода.  Рокс: окисленная форма донора гидрогена после переноса водорода. Аминокислоты: Y (тирозин), K (лизин), R (аргинин), M (метионин), H (гистидин), W (триптофан, отсутствующий в свиной коллагене типа I), F (фенилаланин).

2. Результаты и обсуждение

2.1. Подготовка и характеристика коллагеновой матрицы

Коллаген типа I, получаемый из кожи свинины благодаря своему близкому сходству с человеческой тканью, представляет собой надёжную основу для тканевой инженерии. Этот тип коллагена идеален для биомедицинских применений благодаря своему наличию в коже и четко очерченной тройной спиральной структуре, состоящей из двух α1-цепей и одной α2-цепи (рисунок2A). SDS-PAGE показал целостность и чистоту нашего коллагена из свинины после серии механических процессий гомогенизации, используя коллаген из крысиного хвоста в качестве контроля.

На рисунке 2B показаны отдельные полосы геля SDS-PAGE для коллагена из свиной кожи (P-col) и коллагена, полученного из хвоста крысы (R-col), при этом выделены α 1 и α2 диапазоны ≈150 и 140 кДа соответственно. Дальнейших полос ниже 100 кДа не наблюдалось. Также были различимы более высокие молекулярные полосы, соответствующие димерам (β) и тримерам (y), что свидетельствует о высокой чистоте матрицы коллагена и сохранении целостности после механической обработки. Спектроскопия кругового дихроизма (КД) подтвердила, выявив характерные отрицательные и положительные пики, указывающие на наличие хорошо поддерживаемой тройной спиральной конформации коллагена (рисунок2C). Такая высокая чистота и структурная целостность крайне важны для эффективного взаимодействия с агентами перекрёстного соединения и точного анализа механических свойств.

Сканирующая электронная микроскопия (SEM) была использована для оценки морфологических изменений в коллагеновых матрицах до и после перекрёстного сшивания UVA/R.  (Рисунок 2D) Изначально несвязанный коллаген имел уникальную кристаллоподобную поверхностную текстуру в гидратованно-замороженном состоянии, отклоняющуюся от структуры конвенционной фибриллярной структуры из-за процессов гомогенизации и перемешивания/пенирования, реализованных при его приготовлении (рисунок 2D). Такое намеренное нарушение было необходимо для дальнего проектирования матрицы. После перекрёстного сшивания была зафиксирована заметная трансформация в матриксе коллагена UVA/R. Он отличался сложной, пористой архитектурой с взаимосвязанными пустотами и порами размером от 1 до 20 мкм, что способствовало его трёхмерной сложности. (Рисунок 2Db) Гетерогенность размера пор может способствовать более естественной и динамичной среде для клеток, обеспечивая разнообразную адгезию, миграцию и дифузию питательных веществ, что крайне важно для регенерации и восстановления тканей. Кроме того, реструктурированные коллагеновые волокна могут усиливать механические сигналы, которые могут направлять выравнивание и диерентацию клеток, тем самым способствуя формированию более функциональной и организованной структуры тканей в биомедицинских приложениях.

Кроме того, уплотнение и повышенная степень, вызванные лиофилизацией, свидетельствуют об усиленной устойчивости к механической деформации, что является важной характеристикой биоматериалов, подвергающихся физиологическим нагрузкам (рисунок 2Dc,d). Эта повышенная механическая прочность не только обеспечивает структурную целостность матрицы коллагена при различных физических условиях, но и потенциально продлевает её функциональный срок службы, делая её более пригодной для долгосрочных биомедицинских применений, таких как имплантируемые устройства или тканевые старые устройства.

Рисунок 2.  Структурная и механическая характеристика обработки коллагена до и после UVA/рибофлавина. A) Молекулярная модель структуры коллажа типа I тройной спирали, фундаментального строительного блока матриц коллагена. B) SDS-PAGE анализ, описывающий характеризацию коллагена типа I, извлечённого из крысиного хвоста (R-col) и свиной кожи (P-col). C) спектры кругового дихроизма (CD) R-col и P-col, при этом эллиптичность указывает на сохранение вторичной структуры коллагена. D) Сканирующие электронные микроскопические изображения, представляющие морфологическое исследование несвязанного коллагена и коллагена UVA/R в их гидратированно-замороженном состоянии (a,b), а также в лиофилизированном состоянии (c,d).

2.2. Исследование механизма сшивания UVA/R

Определив фундаментальные аспекты подготовки матрицы коллагена и проанализировав её начальные характеристики, мы затем приступили к изучению механизма сшивания UVA/R — ключевого процесса, который значительно изменяет и усиливает свойства матрицы. В этом разделе исследуется, где на молекуле коллагена образуются перекрёстные связи, роль рибофлавина как катализатора или участника, и далее рассматривается необходимость корректировки перекрёстного сшивания коллагена UVA/R в различных применениях.

2.2.1. Где на молекуле коллагена образуются перекрёстные связи?

В нашем исследовании мы исследовали механизм сшивания коллагена типа I на молекулярном уровне, сосредоточившись на неспиральных областях, которые усиливают механические свойства после сшивания. Используя семь синтетических пептидов, представляющих ключевые аминокислоты — тирозин (Y), лизин (K), аргинин (R), метионин (M), гистидин (H), триптофан (W) и фенилаланин (F) — мы стремились выявить конкретные участки перекрёстного сшивания. Эти аминокислоты были выделены по их особым реактивным функциям и стратегическим положениям внутри молекулы коллагена (рисунок S1, Поддерживающая формация). В частности, тирозин (Y) обладает реактивной фенольной группой, способной к ковалентному связыванию. Лизин (K) и аргинин (R) оснащены аминогруппами, которые являются способными для формирования химических связей.

Гистидин (H) активизируется имидазоловым кольцом, а фенилаланин (F) — ароматическим кольцом, оба являются потенциальными сайтами реактивности. Наши анализы LC-MS выявили чёткую закономерность: модификации после лечения UVA/R происходили исключительно в приливах с тирозином, вероятно, из-за формирования ковалентных дитирозиновых связей (рисунок 3A,B). Эта специфичность была дополнительно усилена отсутствием ковалентных продуктов связей в остальных шести аминокислотах, включая пептиды, что подчёркивает предпочтительные роли тирозина в механизме перекрёстного сшивания (Рисунки S2 и S3, Дополнительная информация). Склонность к образованию ди-тирозина, изначально выдвинутая нашими синтетическими пептидными исследованиями, была окончательно подтверждена анализом LC-MS гидролизатов перекрёстно связанного коллагена UVA/R (рисунок 3C,D).

Во время исследования коллагена с UVA/R, дитирозин был надёжно идентифицирован с помощью режима многократного мониторинга реакций (MRM) в масс-спектрометрии и подтверждён сравнением со стандартом ди-тирозина. Особенно стоит отметить, что наш анализ гидролизатов коллагена LC-MS выявил пик, очень близок, но при этом неугаслый от стандарта ди-тирозина. Признавая вероятность изомерных или пространственных вариаций внутри молекул коллагена, мы осторожно делаем вывод, основываясь на массовых соображениях, что совпадающие пики могут представлять формы дитирозина (рисунок S4, подтверждающая информация). Учитывая белковую последовательность коллагена первого типа свиной (доступные номера A0A1S7J210 для COL1A1 и A0A1S7J1Y9 для COL1A2), полная молекула коллагена должна иметь молекулярную массу 282,85 кДа, включающую 3152 аминокислотных остатка, включая 13 остатков тирозина.

Если предположить, что все эти остатки тирозина одинаково реактивны и доступны для перекрёстного сшивания, наши LC-MS подтверждают, что консервативная оценка сшитого тирозина в матриксе коллагена составляет не менее 14,3% (рисунок S5, подтверждающая информация). Этот вывод играет ключевую роль в оценке степени перекрёстного сшивания коллагена, возникающего при условиях UVA/R, и обогащает наше понимание его механизмов.

Обоснование ди-тирозина в гидролизированном UVA/R перекрёстно сшитом коллагене является ключевым подтверждением исключительности тирозина в схеме перекрёстного сшивания. Такие данные не только подтверждают экспериментальные результаты синтетических пептидов, но и иллюстрируют практическую значимость перекрёстного сшивания тирозина в коллагеновых матрицесах. Наличие дитирозина служит молекулярным признаком успешного сшивания, предоставляя важное понимание, которое, как ожидается, будет решающим для совершенствования технологий сшивания UVA/R в коллагене, предназначенных для биомедицинских целей.

2.2.2. Рибофлавин: Катализатор перекрёстного ссылки или участник?

Исследуя роль рибофлавина в сшиване коллагена, наше исследование выявляет его двойственную функцию как катализатора и участника.  Изучая взаимосвязь между соотношением тирозина и рибофлавина как в пептидной, так и в коллагеновой системах, мы наблюдали схожие заметные тенденции: положительную корреляцию между перекрёстным связыванием и рибофлавином при более низких пропорциях, что меняется при высоких концентрациях (рисунок 3E). Например, в коллагене при более низких концентрациях рибофлавина (соотношение тирозин/рибофлавин от 1/0,0625 до 1/0,25) наблюдалось значительное увеличение возрастного модуля по сравнению с несвязанным коллагеном. Тем не менее, при высоких концентрациях модуль хранения резко деклинирует (рисунок 3F).

Заметное снижение механической прочности коллагенных матриц при повышенной концентрации рибофлавина побудило исследовать основные механизмы.  Наше исследование было основано на теоретической кинетической модели, указывающей на критическую зависимость двух путей фокросслинкинга, опосредованного рибофлавином, от уровней кислорода в окружающей среде. Эта модель вдохновила наше открытие: эффективность перекрёстного сшивания заметно чувствительна к концентрации рибофлавина, особенно в условиях с постоянной доступностью кислорода.

Такое тонкое фотохимическое поведение рибофлавина указывает на два основных пути реакции при возбуждении UVA, как показано на рисунке 1. Изначально рибофлавин действует как фотокатализатор, генерируя ROS, способствующий межмолекулярному сшиванию, преимущественно в тирозиновых остатках, расположенных в неспиральных областях коллагена. Этот процесс усиливает механические свойства матрицы. Однако альтернативный путь становится преобладающим при высоких концентрациях рибофлавина, когда рибофлавин активно участвует в реакции сшивания, истощая ROS и, следовательно, снижая эффективность сшивания. Кроме того, процессы переноса электронов могут вызывать взаимодействие между положительно заряженными аминокислотными остатками, такими как лизин, гистидин и аргинин, а также отрицательно заряженным рибофлавином, что потенциально влияет на механические свойства матрицы коллагена. Этот аспект заслуживает дальнейшего экспериментального подтверждения.

Кроме того, в нашем исследовании было оптимизировано воздействие UVA для перекрёстного сшивания коллагена ma-trix. Наши данные, показанные на рисунке 3E, показывают, что оптимальное воздействие UVA для перекрёстного сшивания матрицы коллагенов составляло 10800 мДж cm_2. За пределами этой дозировки UVA модуль хранения коллагенных матриц заметно уменьшился, что указывает на возможное разрушение коллагена из-за чрезмерного воздействия. Интересно, что для перекрёстного сшивания пептидов оптимальная доза UVA была заметно ниже — 600 мДж cm_2 (рисунок S6, подтверждающая информация); а в другой работе Уэ-мура и др. определили, что оптимальное воздействие UVA для сшивания дентина коллагена у человека составляет 1600 мДж cm_2.

В целом, эти открытия раскрывают дополнительный уровень механизма сшивания UVA/R, подчёркивая критическую необходимость тонкой настройки концентрации рибофлавина и воздействия UVA для практических применений. Заметный разрыв между тканями in vivo и системами перекрёстного сшивания коллагена in vitro значительный. Вариации источников коллагена (содержание остатков тирозина), концентрации, плотности и различных буферных условий требуют индивидуальных подходов к регулировке концентрации рибофлавинов и воздействия UVA для достижения оптимальных результатов сшивания.

Рисунок 3.  Вскрытие механизма сшивания UVA/R в коллагене. A) LC-MS хроматограммы после обработки UVA/R пептида Ac-AGGY-NH2 с контрольными образцами Ac-AGGY-NH2 и рибофлавина.  B) Корреляция масс-спектров с недавно появившимися пиками (a–d) в хроматограммах обработанного UVA/R Ac-AGGY-NH2. C) LC-MS хроматограммы ди-тирозина стандарта и гидролизаты несвязанного коллагена и UVA/R перекрёстно сшитого коллагена, D) с соответствующими масс-спектрами. E) Модуль хранения (G') коллагена в зависимости от воздействия UVA (мДж cm_2), демонстрируя дозозависимое увеличение механических свойств. F) Модуль хранения (G') относительно соотношения Тира (в коллагене)/рибофлавина, иллюстрируя влияние различных концентраций рибофлавина на механическую прочность матриц коллагена.

2.3. Сравнительное исследование влияния UVA/R и химического перекрёстного сшивания на матрицы коллагена

После разъяснения сложности механизма сшивания UVA/R мы обратили внимание на сравнительное исследование, направленное на всестороннюю оценку влияния различных химических методов сшивания на коллагеновые матрицы. Каждый анализ способствует комплексному пониманию структурных и функциональных изменений, вызванных UVA/R и другими химическими методами сшивания.

2.3. 1. Микроспектроскопия Рамана

Микроспектроскопия Рамана дала глубокое понимание молекулярной целостности матриц коллагена, подвергшихся различным методам сшивания. Подробные распределения пиков вместе с соответствующими ссылками собраны в таблице S3 (Вспомогательная информация). В нашем исследовании коллаген Col UVA/R (Xcol_UVA/R) и коллаген EDC/NHS (Xcol_EDC/NHS) сохранили свои типичные вторичные структуры после сшивания по сравнению с несвязанным коллагеном (Col), что подтверждается согласованными амидными полосами во всех образцах: Amide III (1260 cm_1), Amide II (1452 cm_1) и Amide I (1664 cm_1) (Рисунок4A).

Спектры показали, что хотя характерная тройная спиральная структура коллагена была основной, наблюдалось заметное снижение интенсивности пиков (815, 936, 971 и 1080 cm_1), связанных с вибрациями аминокислот в боковой цепочке, участвующих как в реакциях сшивания UVA/R, так и в EDC/NHS. Такие данные свидетельствуют о тонких, но окончательных молекулярных перестановках в арквиттуре коллагена, особенно при распределении колебательных режимов, таких как растяжение C-C, C-C растягивание и колебание CH3 внутри остатков лизина, гидроксилизина и тирозина, что имеет решающее значение для процесса перекрёстного сшивания.

Особенно заметно, что степень редукции интенсивности была более выражена в перекрёстно связанном коллагене EDC/NHS, что свидетельствует о большем содержании перекрёстных сшиваний, опосредованных лизином и гидроксилизином, по сравнению с тирозиновыми при UVA/R. Интересный сдвиг с 936 на 927 cm_1 после перекрёстного сшивания EDC/NHS, возможно, намекает на повышенную десять, возникающую из-за упаковки остатков пролина после сшивания.

Дальнейшее изучение с помощью многомерного анализа главных компонентов (PCA) подтвердило эти структурные нюансы, различая необработанные и перекрёстно связанные образцы (рисунок 4B–D). Чёткая кластеризация баллов PC-3 и PC-4 прояснила молекулярные основы, уникальные для каждого лечения, при этом сшивание UVA/R демонстрирует особый молекулярный отпечаток по сравнению с химическим аналогом. Положительные оценки PC-3 подтверждаются для спектров Xcol_UVA/R, а отрицательные — для Col и Xcol_EDC/NHS. Эта тенденция проявилась в графике загрузки PC-3, где были заметны пики на 936 cm_1 (пролин) и 1688 cm_1 (Амид I).

Параллельно результаты PC-4 показали положительные диапазоны как для Xcol_UVA/R, так и для Xcol_EDC/NHS, тогда как спектры Col сгруппировались в отрицательном диапазоне. Соответствующие нагрузки PC-4 точно отображали пики, связанные с перекрёстным сшивом, в диапазонах 896, 980, 1099, 1309, 1439 и 1655 cm_1, обозначающие колебательные режимы 0 (C-C), 0 (C-N), а также деформации скручивания, изгибания или виляния CH3/CH2, и другие, подчёркивая молекулярные различия, управляемые сшивкой.

Микроспектроскопия Рамана выявила молекулярные отпечатки пальцев, которые проясняют изменения, происходящие на молекулярном уровне при коллагене после сшивания, а также различные характерные характеристики коллагена, связанного с помощью методов UVA/R и EDC/NHS. Эти спектроскопические результаты играют ключевую роль в формировании функционализации коллагена для продвинутых биомедицинских применений.

2.3.2. Хроматография с исключением размеров переваренного коллагена

Хроматография с исключением размера (SEC) образцов, переваренных коллагеназой, выявила заметные различия в молекулярном профиле коллагеновых матриц после перекрёстного соединения (рисунок 4E–G). Поскольку коллагеназа в основном расщепляет пептидные связи внутри молекул коллагена в характерных триплетах Gly-X-Y, где X и Y часто являются остатками пролина или гидроксипролина, процесс ферментативного разделения приводит к образованию меньших пептидных фрагментов. Наличие крупных фрагментов пептида в перекрёстно сшитых образцах, особенно заметных в области пика 1, свидетельствует об эффективности перекрёстного сшивания в препятствовании ферментативному расщеплению. Это открытие было особенно заметно в UVA/R-связанном сампле, где значительные пептидные сущности сохранялись в определённой степени.

Рисунок 4.  Комплексная характеристика несвязанного коллагена (Col), связанного коллагена UVA/R (Xcol_UVA/R), EDC/NHS связанного коллагена (Xcol_EDC/NHS) и генипиновых коллагена (Xcol_Genipin). A–D) Микроспектроскопический анализ Рамана: (A) Средние спектры Рамана, выделяющие чёткие пики и закономерности. Каждое состояние повторялось как минимум три раза (n ≥  3), при этом для каждой реплики получалось несколько спектров (n ≥ 25). Результаты многомерного анализа данных включают результаты анализа основных компонентов (PCA) с использованием спектральных нагрузок PCA для PC-3 и PC-4 (C), график оценок PC-4 против PC-3 (B), а также статистическое представление баллов PC-3 и PC-4 как средних значений ± SD (D). Эллипсы доверия в (B) обозначают 95% доверительные интервалы. E–G) Анализ хроматографии с исключением размера: следы, отражающие поведение коллагеновых матриц, обнаруженные с помощью УФ-детектора. Крупные планы Пик 1 и Пик 2 подробно описаны в (F) и (G). Динамический H) модуль хранения (G') и I) потерь (G''), извлекаемый из плато LVE-области во время частотных сканов.

аналогично химически связанным образцам. Такое исследование подчёркивает сопоставимую эффективность кроссшипинга UVA/R с традиционными химическими методами, такими как EDC/NHS и генипин, в защите коллагеновых матриц от ферментативного переваривания. Кроме того, сшивание UVA/R продемонстрировало авантальный профиль с меньшим числом мелких побочных продуктов по сравнению с химическим сшивом.

Хроматограммы для образцов EDC/NHS и обработанных генипином показали дополнительные пики, что указывает на наличие побочных продуктов, которые могут привести к цитотоксическому экту или вызвать иммунные ответы при использовании в биомедицинских приложениях. В отличие от этого, процесс сшивания UVA/R, по-видимому, привёл к более чистому профилю с меньшей фрагментацией, что может привести к более благоприятному профилю безопасности для применения in vivo. Молекулярная целостность, основанная на сшиване UVA/R, в сочетании с уменьшенным профилем побочных продуктов, делает его мощным методом подготовки биоматериалов на основе коллагена для регенеративной медицины.

2.3.3. Реологические свойства

Реологические свойства перекрёстных коллагенных матриц, проанализированные с помощью амплитуды сдвигового напряжения и частоты, дали представление о механических последствиях каждой стратегии сшивания при физиологических температурах. (Рисунок 4H,I) Xcol_UVA/R продемонстрировала улучшенный упругий профиль, что подтверждается модулем хранения, без соответствующей потери прочности материала. Этот баланс эластичности и долговечности подчёркивает потенциал сшивания UVA/R для укрепления механической целостности коллагеновых каркасов без потери способности материала поглощать и рассеивать энергию, что является важной характеристикой биоматериалов, необходимых для динамических физиологических сред.

С другой стороны, Xcol_EDC/NHS показал неожиданно более низкий уровень хранения (рисунок 4I), что говорит о том, что химическое сшиване с EDC/NHS действительно изменяет материал, но может не равномерно учитывать упругие свойства матрицы коллагена. Это открытие может иметь последствия для применения перекрёстных материалов EDC/NHS в ситуациях, где механическая устойчивость является обязательным условием. В отличие от этого, Xcol_Genipin демонстрировал заметное увеличение степени, что свидетельствует по более высокому модулю накопления. Однако повышенная жёсткость может ограничивать функциональную совместимость материала, особенно в целлюлярной активности. Материалы с высоким уровнем ИППП могут значительно затруднять миграцию и пролиферацию клеток, что критически важно для регенерации и интеграции тканей.

В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что кроссшипинг UVA/R достигает оптимального баланса жёсткости и гибкости, что может способствовать функциям клеток, открывая перспективный путь для дальнейшего развития коллагеновых скаолдов в регенеративной медицине.

2.3.4. Тепловая стабильность

Измерения диренциальной сканирующей калориметрии (DSC), показанные на рисунках 5A, B, дали важные данные о стабильности коллагенных матриц. Температура денатурации (Tm), наблюдаемая как пик на кривых DSC, отмечает точку транзиции, где тройная спираль коллагена начинает раскручиваться из-за разрушения стабилизирующих водородных связей. Это тепловое событие сопровождается поглощением тепла, которое количественно измеряется как изменение энтальпии (ΔH).

В нашем исследовании было зафиксировано заметное повышение уровня Тм для сшитых коллагенных образцов. В частности, Xcol_UVA/R и Xcol_EDC/NHS показывают значения Tm при 75 и 76,0 °C соответственно, что указывает на повышенную термическую стабильность, потенциально способствующую сохранению целостности конструкции при физиологических температурах. Xcol_Genipin, несмотря на более низкий Tm при 60,1 °C, всё равно демонстрирует повышенное тепловое сопротивление по сравнению с несвязанным коллагеном. Изменения энтальпии (ΔH), связанные с процессом денатурации, как показано на рисунке 5B, дополнительно подтверждают эти данные: Xcol_UVA/R и Xcol_EDC/NHS демонстрируют значительное поглощение тепла, отражающее энергию, необходимую для нарушения усиленной структуры коллагена из-за перекрёстного сшивания. Эти термодинамические характеристики свидетельствуют о том, что перекрёстное сшиване обеспечивает дополнительную стабильность коллагеновых матриц, что крайне важно для их работы при тепловом напряжении in vivo.

2.3.5. Сопротивление деградации

Наше исследование расширилось на сравнительный анализ деградации перекрёстно сшитых коллагеновых матриц в физиологически значимых условиях с использованием фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) и коллагеназных растворов (Рисунок 5C,D). Профиль деградации Xcol_UVA/R был особенно убедителен, демонстрируя устойчивость, сопоставимую с химически связанными матрицами, что ознаменовало значительное улучшение по сравнению с несвязанным коллагеном. Это наблюдение имеет ключевое значение, так как впервые напрямую сравнило устойчивость к деградации сшитого коллагена UVA/R с химически связанными вариантами. Xcol_EDC/NHS продемонстрировала исключительную надёжность PBS, сохраняя более 60% его массы в течение 30 дней, что свидетельствует о её потенциале для применений, где расширенная стабильность имеет первостепенное значение. Генипин-связанный коллаген также проявил удивительную устойчивость в растворах коллагеназы, что указывает на его пригодность для сред с активной ферментативной деградацией.

Однако надёжность этих химически связанных матриц вызывает опасения в контексте тканевой инженерии, где кинетика деградации каркасов должна быть синхронизирована с регенерацией тканей. [75] Биоматериалы, которые разлагаются слишком медленно, могут нарушить деликатный процесс формирования новых тканей, потенциально повлияв на миграцию клеток, васкуляризацию и естественный процесс ремоделирования по типу «тсу». [30] Более того, постоянное присутствие недеградированных материалов может вызвать длительный воспалительный ответ, что может негативно сказаться на результатах заживления. [31] В этой инженерии идеальный биоматериал должен обеспечивать начальную механическую поддержку, но постепенно уступать место новообразованному трассу. Поэтому крайне важно оптимизировать скорость деградации для обеспечения плавного перехода от каркасов к натуральной ткани. Наши результаты подчёркивают необходимость тонкого подхода к проектированию коллагеновых каркасов, направленного на создание тонкого равновесия, поддерживающего начальное восстановление тканей и, следовательно, позволяющего интеграцию натуральных тканей без вызова хронического воспаления или других негативных реакций.

2.3.6. Тест на цитотоксичность in vitro

Биосовместимость наших коллагеновых матриц была оценена с помощью анализа CCK-8 с использованием фибробластов L929, следуя рекомендациям DIN EN ISO 10993–5: 2009 и DIN EN 10993-12: 2021. Стандарт утверждает, что биоматериалы не должны снижать жизнеспособность клеток ниже 70% контроля, чтобы считаться биосовместимыми. Как показано на рисунке 5E, сшитые коллагеновые матрицы, в частности Xcol_EDC/NHS, демонстрировали сниженную жизнеспособность клеток, что указывает на потенциальную цитотоксичность из-за остаточных агентов сшивания или побочных продуктов. В отличие от этого, Xcol_UVA/R превысил порог биосовместимости с жизнеспособностью выше 80%, что свидетельствует о его пригодности для применения в тканевой инженерии благодаря благоприятному балансу стабильности и деградации.

Рисунок 5.  Характеристика коллагеновых матриц и биологическая оценка in vitro. A) Дифференциальные сканирующие калориметричные кривые (DSC), иллюстрирующие тепловые переходы матриц коллагена, отмеченные пиковыми температурами (Tm). B) Изменения энтальпии (ΔH) во время денатурации коллагеновых матриц. Потеря массы при in vitro деградации в растворе С) фосфатно-буферированного физиологического раствора (PBS) и растворе коллагеназы. E) Тест на цитотоксичность in vitro с использованием фибробластов L929 с помощью анализа CCK-8, согласно стандарту ISO 10993–5. F) Репрезентативные изображения конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) окрашивания L929-клеток L929 живыми мертвыми (Calcein-PI), культивируемых на коллагеновых каркасах через 1, 4 и 7 дней после посева. G) Количественный анализ соотношения живых и мёртвых клеток, полученный из изображений CLSM, с использованием программного обеспечения ImageJ для количественной оценки клеток. H) Количественная оценка живых клеток, выделяющая жизнеспособность и размножение клеток в течение периода исследования. Статистическая оценка для частей (G) и (H) проводилась с использованием ANOVA для множественных сравнений в разные временные моменты, с конкретными сравнениями между группой Xcol_UVA/R и другими группами. (Шкалы на изображениях живого окрашивания соответствуют 100 μм. Кальцеин зелёный, PI красным.).

Окрашивание живыми мертвыми (рисунок 5F) с последующим количественным анализом (рисунок 5G,H) дополнительно подчеркнуло превосходную перформность Xcol_UVA/R, что способствовало выживанию и пролиферации клеток. Изначально, на первый день, соотношения живых и мёртвых для групп Col и Xcol_UVA/R были сопоставимы, что подтверждает результаты экстракционного цитотоксичного теста, показанного на рисунке 5E. Однако по мере продвижения культуры к 4-му и 7-му дням, Xcol_UVA/R каркас продемонстрировал своё превосходство благодаря значительно повышенной жизнеспособности и пролиферации клеток, вероятно, благодаря его биомеханическим особенностям. В то время как несвязанный коллагеновый каркас, несмотря на биосовместимость, не обладал необходимой структурной целостностью для оптимального взаимодействия клеток и материала, что подтверждается его работой в течение 4 и 7 дней. В отличие от этого, матрицы коллагена, связанные с EDC/NHS и генипином, демонстрировали снижение соотношения живых клеток на протяжении всего исследования, что может вызвать опасения относительно их цитотоксичных профилей.

Наши комплексные анализы, охватывающие профили ферментативных диг-гигонов, механическую прочность, термическую устойчивость и устойчивость к деградации, при сопоставлении с оценкой цитотоксичности in vitro, выявляют многогранную оценку сшитых коллагеновых матриц для биомедицинских применений. Xcol_UVA/R выделяется своим сбалансированным профилем; Он обладает сопоставимой термической стабильностью и устойчивостью к разложению с химически сшитыми аналогами, сохраняя структурную целостность при физиологических условиях, поддерживая устойчивую жизнеспособность клеток и благоприятные взаимодействия между клетками и материалом.

Результаты ферментативного переваривания, указывающие на снижение деградации в сшитых образцах, совпадают с наблюдаемым улучшением механических и тепловых свойств, подтверждая эффективность сшивания в укреплении устойчивости матрикс. Однако механическая прочность и сниженная разлагаемость, как видно в inXcol_EDC/NHS и Xcol_Genipin, могут нарушать хрупкое равновесие, необходимое для регенерации тканей. Эти матрицы демонстрируют ограниченное разрушение ферментов и повышенную термическую устойчивость, однако эта прочность может значительно затруднять естественное ремоделирование тканей, что свидетельствует по их низкой жизнеспособности клеток.

В области тканевой инженерии, где ожидается, что деградация каркасов проложит путь к новым тканям для соединения, предпочтительнее использовать такие материалы, как Xcol_UVA/R, которые обеспечивают оптимальный баланс между стабильностью и разлагаемостью. Они способствуют клетческим функциям без затяжного воспалительного ответа, тем самым усиливая результаты исцеления. В заключение, выбор метода сшивания существенно влияет на производительность каркасов, при этом UVA/R-склейка становится перспективным способом создания биосовместимых, стабильных, но разлагаемых каркасов, способствующих успешному применению тканевой инженерии.

2.4. Гистологическая оценка подкожных имплантатов

Исключительная биосовместимость и остеопроводимость коллагена делают его краеугольным камнем для костной трансплантации. Тем не менее, его полезность исторически ограничивалась биомеханической стабильностью. Благодаря применению инновационного процесса сшивания UVA/R мы успешно преодолели это ограничение, существенно повысив механическую устойчивость наших коллагеновых каркасов. Интеграция неорганических заменителей костей, таких как гидроксиапатит и β-TCP, обеспечивает необходимую механическую поддержку для долгосрочного ремоделирования костей, при этом лишённые компоненты ЭБМ, необходимые для ранних взаимодействий клеток и разложения скаф-фолд.

Наш инновационный инъекционный композитный каркас с перекрёстно сшитой коллагеновой матрицей UVA/R и BS разработан для оптимизации как начального взаимодействия клеток, так и устойчивого ремоделирования костей. Благодаря подкожным обследованиям и отделённым гистологическим оценкам имплантированных каркасов мы добились тонкого понимания целостности материала и динамики реакции. Это включает глубокий анализ реакций тканей, особенно иммунных ответов, чтобы определить биосовместимость и получить критические выводы для будущих применений. Такой методичный подход подчёркивает нашу приверженность тщательному исследованию взаимодействия между нашими инженерными матрицами и биологическими системами.

2.4. 1. Анализ реакций тканей

Окрашивание пентахромом Моват — это многофункциональная гистологическая техника, которая чётко маркирует различные компоненты соединяющей ткани, облегчая их дифференциацию в гистологических срезах. В этом исследовании пентахромное окрашивание Моват было использовано для визуального различия и частичного количественного анализа распределения ГАГ и коллагена в срезах ткани, что позволило выявить различие поведения имплантированных неперекрёстно связанных коллагеновых и UVA/R коллагеновых каркасов (BS-Col и BS-Xcol_UVA/R) в тканевой среде (рисунок 6A–C). К 10-му дню после имплантации обе группы показали наличие коллагена внутри имплантационных ложей (рисунок 6B).

В частности, группа BS-Xcol_UVA/R продемонстрировала выдающееся прикрепление к поверхности замены костей, в отличие от слабо связанного матрикса, наблюдаемого в группе BS-Col, что указывает на повышенную устойчивость матрицы, потенциально обеспечиваемую процессом перекрёстного сшивания UVA/R. Количественный анализ дополнительно подтвердил эти выводы, показав более высокое содержание коллагена в сайтах имплантации BS-Xcol_UVA/R по сравнению с BS-Col (рисунок 6C), что может подтвердить глубокое влияние перекрёстного сшивания на целостность матрицы. По мере развития формирования тканей изначально схожие уровни гли-козаминогликов (GAG) принимали значимый поворот, что свидетельствовало о снижении со временем, что свидетельствует о постоянном ответе ткани, клеточной активности и динамическом процессе ремоделирования матрикса со временем.

К 30-му дню группа BS-Xcol_UVA/R показала поразительное удержание содержания коллагена, при этом матрица сохранялась вокруг поверхностей замены костей. Это устойчивое присутствие, подтверждённое количественным анализом, подчеркнуло устойчивое влияние сшивания UVA/R на устойчивость матрицы. (Рисунок6C) Ткань внутри каркасов созрела, что подтверждается увеличением сосудистой активности в обеих группах. Однако был выявлен выраженный иммунный профиль; группа BS-Col показала более высокую распространённость макрофагов и многоядерных гигантских клеток, что свидетельствует о постоянной реакции на деградацию каркасов.

2.4.2. Оценка иммунного ответа

Наши гистологические исследования иммунных ответов в подкожных местах имплантации выявили тонкие взаимодействия между защитой хозяина и имплантированными композитами на основе коллагеновой матрицы. Изначально, на 10-й день, вокруг имплантов были заметны провоспалительные макрофаги, положительные CD11c.

Рисунок 6.  Реакция тканей in vivo и иммунный ответ на материалы на основе матрикса коллагена: BS-Col и BS-Xcol_UVA/R. A) Схематическая иллюстрация, изображающая инъекционный композитный материал, состоящий из матрицы коллагена и заместителя костной ткани (BS), подкожно имплантируемых мыши BALB/c.

B) Репрезентативные гистологические изображения областей имплантации BS-Col и BS-Xcol_UVA/R на 10-й и 30-й день после имплантации с использованием окрашивания Pen-tachrome от Movat. C) Количественная оценка пентахрома Моват с помощью цветового анализа деконволюции с использованием ImageJ. Жёлто-зелёный = коллаген, зелёно-синий = гликозаминогликан (GAG). Представлено в процентах от общей площади пятна. D) Репрезентативные иммуногистохимические изображения провоспалительных (CD11c) и противовоспалительных (CD163) макрофагов в области имплантации соответствующих групп. E) Гистоморфометрический (количественный) анализ подтипов CD11c-положительных и CD163-положительных макрофагов в области имплантации соответствующих групп с использованием ImageJ. Чёрные звёзды = костный заместитель (BS), красные звёзды = новообразованные сосуды, оранжевый треугольник = коллаген, зелёный треугольник = многоядерные гигантские клетки, жёлтый треугольник = CD11c-позитивные клетки, синий треугольник = CD163-положительные клетки. Шкала = 100 мкм.

В обеих группах на периферии присутствует меньше CD163-положительных противовоспалительных макрофагов (рисунок 6D). Количественные оценки (рисунок 6E) дополнительно очерчили иммунный ландшафт земли, показав преобладание макрофагов M1 (положительный CD11c) над макрофагами M2 (положительный CD163) в группе BS-Col, при этом количество клеток составляло 153,3 ± 29,0 клеток/см² и 50,0 ± 14,7 клеток/см² соответственно. В отличие от этого, группа BS-Xcol_UVA/R демонстрировала меньшее количество макрофагов M1 (122,0 ± 30,5 клеток/см²) и более высокую частоту M2-макрофагов (79,9 ± 24,2 клеток/см²), что указывает на умеренный провоспалительный ответ.

К 30-му дню был заметен заметный сдвиг поляризации макрофагов. Группа BS-Col показала высокую экспрессию CD11c (173,0 ± 42,1 клетки/см²) в районе имплантата с минимальной экспрессией CD163. В отличие от этого, группа BS-Xcol_UVA/R продемонстрировала заметное увеличение количества противовоспалительных CD163-положительных макрофагов (115,0 ± 23,9 клеток/см²) и снижение экспрессии CD11c (76,5 ± 17,9 клеток/см²), как показано на рисунке 6E. Этот сдвиг свидетельствует о значительном уклоне в сторону противовоспалительного фенотипа в группе BS-Xcol_UVA/R, с резким отходом от устойчивой провоспалительной среды в группе BS-Col.

Гистологическая оценка подкожных имплантатов предоставляет убедительные доказательства эффективности процесса сшивания UVA/R в улучшении биостабильности и интеграции коллагеновых матриц в биологическую среду.   Наличие провоспалительных макрофагов на ранних стадиях, переходящее в противовоспалительный профиль в группе BS-Xcol_UVA/R, указывает на типичный острый иммунный ответ, необходимый для заживления ран и интеграции имплантов. Снижение процесса деградации и наличие окисленного тирозина (DOPA) коллагена после обработки UVA/R, вероятно, синергетически способствуют противовоспалительному эффекту. ДОПА, который также был одним из продуктов в пептидах, содержащих тирозин после обработки UVA/R (рисунок 3B), играет значительную роль в снижении воспаления, потенциально повышая биосовместимость каркасов колла-гена.

Это открывает возможности для дальнейших исследований фотохимически связанных биоматериалов в тканевой инженерии и регенеративной медицине, особенно для понимания и использования этих механизмов для контролируемых иммунных респонсов в интеграции и функциональности клинических имплантатов. Хотя наше исследование даёт всестороннее понимание биосовместимости и механических свойств, будущие исследования, включающие анализ второго гармонического поколения (SHG), могут дать дополнительное понимание ультраструктурных изменений фибриллярности коллагенов, обогащая наше исследование фотохимически связанного коллагена для тканевой инженерии и регенеративной медицины.

Оптимизированный процесс сшивания UVA/R улучшает интеграцию наших коллагенных каркасов с материалами BS, создавая высокоэффективное решение для костной трансплантации. Этот инновационный подход не только укрепляет биомеханическую устойчивость, но и максимизирует биосовместимость композитного материала, делая его отлично подходящим для клинических применений. Включая неорганические материалы в матрицу коллагена, мы решаем необходимую надёжную механическую поддержку, решающую для успешной регенерации и ремоделирования костей. Ключевым является то, что наш метод усиливает начальное взаимодействие между клетками и каркасами — ключевой элемент тканевой инженерии, обеспечивая при этом механическую поддержку, необходимую для регенерации костей.

Помимо регенерации костей, универсальность коллагена UVA/R охватывает широкий спектр применений. Он служит основой для восстановления хряща, где его способность поддерживать адгезию и пролиферацию хондроцитов может быть крайне важной. В заживлении ран её отличная биосовместимость и благоприятная среда для миграции клеток ускоряют восстановление тканей.

Для инжиниринга сосудистых тканей каркас поддерживает рост эндотелиальных и гладкомышечных клеток, необходимых для формирования функциональных кровеносных сосудов.  При регенерации нервов каркас может направлять вырастание невритов, предлагая перспективный путь для восстановления повреждений нервов. Кроме того, индивидуальные скорости разложения материала и совместимость с различными биоактивными агентами делают его отличным кандидатом для таргетной доставки лекарств и систем контролируемого высвобождения.

Для полного раскрытия потенциала этих материалов в клинических условиях необходимо более глубокое понимание их механизмов. Передовые технологии визуализации и спектроскопии сыграют ключевую роль в этом исследовании, предоставляя представление о взаимодействии каркаса с биологическими тканями и их влиянии на поведение клеток. Это углубленное понимание критически важно для адаптации материалов под специфические требования различных применений регенеративной медицины, обеспечивая оптимальные результаты восстановления и регенерации тканей.

3. Заключение и перспективы

Сложное взаимодействие между сложностью молекулы коллагена и загадочным процессом фотохимического скрепления UVA/рибофлавин (UVA/R) — это увлекательная загадка, которую наше исследование мастерски разгадало. Наше всестороннее исследование механизма сшивания коллагена с использованием шести стратегически отобранных синтетических пептидов дало впечатляющие открытия.  HPLC, LC-MS постоянно выявляют предпочтение тирозина среди аминокислот, что значительно расширяет наше понимание широко используемой техники сшивания UVA/R, особенно в офтальмологии.

Предварительное таргетирование тирозина проливает свет на специфические молекулярные пути, участвующие в стабилизации коллагена, вызванной ультрафиолетом. Наши результаты подчёркивают роль тирозина в перекрёстном сшивании, вызванном УФ-излучением, а фенольная группа тирозина также известна как восприимчивая к фотоактивации, что открывает потенциальные инженерные стратегии для искусственных или функционализированных биоматериалов. Помимо разъяснения механизмов перекрёстного сшивания UVA/R, результаты показывают ключевую роль тирозина в проектировании и оценке биоматериалов на основе коллагена и стимулируют переоценку существующих материалов, особенно химически модифицированных из-за тирозиновой перекрёстной склейки, что вызывает актуальные вопросы как для заявителей, так и у регулирующих органов.

Представленный в этом исследовании также призывает к необходимости переоценки и оптимизации метода сшивания UVA с акцентом на максимизацию управляемости реакции, например, вовлечения определённых остатков тирозина в процесс при контролируемых условиях реакции. Благодаря разработке синтетических пептидов, зеркалящих потенциальные участки перекрёстного сшивания, мы выявили критическое влияние остатков тирозина на механизм сшивания, особенно тех, что находятся в неспиральных областях, жизненно важных для усиления механических свойств. Наши исследования in vivo на мышах BALB/c подтвердили биосовместимость и функциональную эффективность сшитого коллагена UVA/R, подтверждая его превосходный потенциал как биоматериала для терапевтического использования.

Wu Xi Further Pharmaceutical Co., Ltd

Основные продукты

Пальмитоилэтаноламид (PEA) Micro (CAS 544-31-0)

Спермидин тригидрохлорид (CAS 334-50-9)

Птеростильбен (CAS 537-42-8)

Лютеолин (CAS 491-70-3)

Voglibose (CAS 83480-29-9) JP GMP

Mailbox:wuxifurther@gmail.com    

WhatsApp:+86 18036885286