Структурное подтверждение аминокислотного перекрестно-сшитого гиалуроната натрия (гиалуроновой кислоты, ГК) требует комплексной характеристики с помощью различных аналитических методов для определения места перекрестной сшивки, степени перекрестной сшивки и молекулярной массы.
Изменение веса и целостность химической структуры. Ниже приведены подробные шаги и методы:
1. Очистка и предварительная обработка образца.
Диализ/ультрафильтрация: удаление непрореагировавших аминокислот, агентов сшивания и побочных продуктов в виде мелких молекул.
Заморозкая и высушивая образцы, мы получаем сухие образцы для последующего анализа.
2. Подтверждение химической структуры.
(1) Инфракрасная спектроскопия (ФТ-ИК)
Цель: подтвердить образование поперечных связей (таких как амидные связи, эфирные связи).
Характерные пики:
Гиалуронат натрия: карбоксилат (COO⁻, ~1600 см⁻¹ и ~1400 см⁻¹), гидроксил (~3400 см⁻¹).
После перекрестной связи аминокислот: новая полоса амида I (C=O, ~1650 см⁻¹), полоса амида II (N-H, ~1550 см⁻¹) или эфирная связь (C-O <1650 см⁻¹). Добавляются , ~1730 см⁻¹).
(2) Ядерный магнитный резонанс (ЯМР)
H ЯМР и C ЯМР:
Обнаружите сигналы протонов/углерода каркаса гиалу HA (глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина).
Подтвердите характерные пики аминокислот (таких как α-H), Сигналы межмолекулярных связей (таких как недавно образованные амидные связи или эфирные связи).
Двумерная ЯМР (COSY, HSQC, HMBC): Помогает в определении мест перекрестных связей.
(3) Масс-спектрометрия (МС)
МАЛДИ-ТОФ МС или ЭСИ-МС:
Измерьте изменение молекулярного веса до и после сшивания, чтобы проверить степень сшивания.
Обнаружение возможных фрагментов деградации или побочных продуктов.
3. Анализ степени перекрестной связи и молекулярного веса.
(1) Определение степени сшивки.
Метод TNBS (тринитробензолсульфоновая кислота): количественно определяет непрореагировавшие свободные аминогруппы и косвенно рассчитывает степень сшивки.
Элементный анализ: оцените количество аминокислот, введенных в результате изменения содержания азота.
(2) Распределение молекулярной массы.
Гель-проникающая хроматография (GPC/SEC):
Используйте многоугольное световое рассеивание (MALS) для определения абсолютной молекулярной массы.
Сравните изменения молекулярного веса и распределения до и после сшивки.
4. Термическая и морфологическая характеристика.
(1) Дифференциальная сканирующая калориметрия (DSC)
Обнаружить изменение температуры стеклования (Tg) после сшивки, отражающее ограничение движения молекулярной цепи.
(2) Термогравиметрический анализ (TGA) оценивает термическую стабильность. Сшивка обычно повышает температуру разложения.
(3) Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)
Наблюдайте микроскопическую морфологию после сшивания (например, пористую структуру или плотную сеть).
5. Биологическая и функциональная проверка.
(1) Ферментативная стабильность.
Проведите обработку гиалуронидазой и сравните скорость деградации до и после перекрестной сшивки.
(2) Свойства набухания.
Определите скорость равновесного набухания сшитого гидрогеля, чтобы отразить плотность сети сшивания.
6. Другие вспомогательные методы.
Рентгеновская дифракция (XRD): Анализируйте изменение кристалличности (перекрестная сшивка часто приводит к аморфизации).
Рамановская спектроскопия: дополнительное подтверждение информации о химических связях.
Флуоресцентная маркировка (если аминокислота содержит ароматические группы): Отслеживайте сайт перекрестной связи с помощью флуоресцентной спектроскопии.
Заметки
1. Контрольный эксперимент: несшитый гиалуронат натрия и свободные аминокислоты должны быть установлены в качестве контроля.
2. Оптимизация условий: условия реакции перекрестной сшивки (рН, температура, время) могут влиять на структуру, и это необходимо отметить в отчете.
3. Ассоциация данных: Объедините результаты различных методов. (Третий этап: PO_OUT -> PO_IN)
Благодаря вышеуказанному многомерному анализу, химическая структура и перекрестная связь гиалуроната натрия, перекрестно связанного с аминокислотами, могут быть полностью подтверждены.
